如何用二氧化碳培養(yǎng)箱做細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試驗(yàn)？

【實(shí)驗(yàn)方法與步驟】

（1）細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)：HeLa細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(見(jiàn)細(xì)胞傳代培養(yǎng)）。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加入順鉑溶液（生理鹽水配置）至終濃度為20μmo1/L,二氧化碳培養(yǎng)箱設(shè)定37℃，5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)?？瞻讓?shí)驗(yàn)對(duì)照加入等體積的生理鹽水，同樣條件繼續(xù)培養(yǎng)。24h后進(jìn)行染色及形態(tài)學(xué)觀察。      

（2）胰酶消化細(xì)胞，將培養(yǎng)基上清及消化下來(lái)的細(xì)胞一同轉(zhuǎn)入離心管中600~800r/min離心10min。     

（3）吸去上清，用1mL PBS重懸細(xì)胞沉淀，并轉(zhuǎn)入1.5mL微量離心管中，600~800r/min離心10min。    

（4）吸去上清，用500μL PBS重量細(xì)胞沉淀，取178μL轉(zhuǎn)入0.5mL的微量離心管中，加入PI 20μL（終濃度100μg/mL），Hoechest 33342 2μL（終濃度10μg/mL），混勻，37℃溫箱中避光標(biāo)記15min。     

（5）600~800r/min離心10min，棄上清，加50μL PBS重懸細(xì)胞。    

（6）分別從實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中取10μL細(xì)胞懸液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片。     

（7）熒光顯微鏡20倍物鏡在紫外光激發(fā)下觀察，可觀察到凋亡細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生明顯的改變，出現(xiàn)染色質(zhì)凝集及邊緣化。

【注意事項(xiàng)】       

（1）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后收集細(xì)胞時(shí)，注意要同時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清液。   

（2）懸浮細(xì)胞時(shí)動(dòng)作要輕柔，避免損傷細(xì)胞。     

（3）在實(shí)驗(yàn)中可同時(shí)設(shè)計(jì)壞死細(xì)胞的對(duì)照，例如，取正常細(xì)胞經(jīng)低滲后進(jìn)行染色觀察。