怎樣用恒溫培養(yǎng)箱做提蛋白及蛋白定量的濃度實驗？

1、吸棄培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液。

2、往培養(yǎng)皿中加入2ml 冷的PBS輕輕蕩洗2~3次，zui后一次，吸干培養(yǎng)皿中的PBS。

3、每個培養(yǎng)皿中加入70μl（以FLS細(xì)胞為例）裂解液。

裂解液的配置：

RIPA裂解液：蛋白酶/磷酸酶抑制劑混合物：RIPA裂解液（中）B液=100：1：1

（配置時實際配置的體積需比理論值高出幾十微升）

4、將加入裂解液的培養(yǎng)皿輕輕搖晃，使裂解液與貼壁細(xì)胞充分接觸，放入—70℃的冰箱，冷凍10分鐘。

5、裂解完后，用干凈的刮刀將細(xì)胞刮于培養(yǎng)皿的一處（動作要快，每個皿控制在3min），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml 離心管中。（整個操作盡量在冰上進(jìn)行）

6、將離心管置于小型離心機(jī)上渦旋一下，然后置于4℃冰箱放置30min。（期間從冰箱拿出再進(jìn)行渦旋一次）

7、將離心管放入高速離心機(jī)，于4度下12000rpm 離心5min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）

8、取出離心管，吸取上清液，上清液即蛋白液，對其進(jìn)行定量，轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管。（定量需用的槍。）

9、對提取的上清液進(jìn)行蛋白濃度的定量

蛋白定量的過程

①取干凈的96孔板，進(jìn)行區(qū)域選擇板底掃描即讀板（切勿用手觸摸板底）

②首先在96孔板中加入18ul的PBS（做標(biāo)準(zhǔn)曲線的PBS）

③在18ul的PBS中加入2ul的樣品

④zui后在加入200ul的BCA（加入后的BCA不進(jìn)行與樣品的混合，而是鋪在樣品的上面，用吹風(fēng)機(jī)除去上方的氣泡）

         BCA的配置： BCA試劑A：BCA試劑B=50：1

⑤放置37°恒溫培養(yǎng)箱孵育30min

⑥讀板（吸光光度值為562）

10、對剩余的樣品按照體積5：1的比例加入Loading Buffer（6X）

11、將加好的樣品放入離心機(jī)順離，使離心管內(nèi)壁的樣品甩下。

12、將樣品放入恒溫金屬浴鍋中100℃煮7min

13、將煮好的蛋白放入—20℃冰箱中備用（在離心管壁上標(biāo)記好樣品名稱、日期）