恒溫培養(yǎng)搖床蛋白質(zhì)表達(dá)和純化

在實(shí)驗(yàn)室中，恒溫培養(yǎng)搖床在蛋白質(zhì)表達(dá)和純化過程中扮演著重要角色，尤其是在微生物表達(dá)系統(tǒng)中。以下是使用恒溫培養(yǎng)搖床進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和純化的步驟：

蛋白質(zhì)表達(dá)

菌株選擇與轉(zhuǎn)化：

選擇適合的宿主菌株（如大腸桿菌、酵母等）。

通過轉(zhuǎn)化將含有目標(biāo)基因的表達(dá)載體引入到宿主細(xì)胞中。

接種與預(yù)培養(yǎng)：

將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞接種到含有適當(dāng)抗生素的液體培養(yǎng)基中。

在恒溫培養(yǎng)搖床上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，使細(xì)胞適應(yīng)生長條件并達(dá)到對數(shù)生長期。

誘導(dǎo)表達(dá)：

向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑（如IPTG、乳糖、醇等），以啟動基因表達(dá)。

將培養(yǎng)容器放回?fù)u床上，在適宜的溫度下繼續(xù)培養(yǎng)，通常在幾個小時到過夜。

監(jiān)控表達(dá)：

在誘導(dǎo)表達(dá)過程中，可以取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析，以監(jiān)控蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。

蛋白質(zhì)純化

細(xì)胞收集：

表達(dá)完成后，通過離心將細(xì)胞從培養(yǎng)基中分離出來。

細(xì)胞裂解：

使用物理或化學(xué)方法（如超聲波破碎、高壓勻漿等）裂解細(xì)胞，釋放出蛋白質(zhì)。

初步純化：

根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)，可能需要經(jīng)過初步純化步驟，如鹽析、離心去除細(xì)胞碎片等。

親和層析：

如果蛋白質(zhì)帶有融合標(biāo)簽（如His標(biāo)簽、GST標(biāo)簽等），可以使用親和層析柱進(jìn)行純化。

將裂解液上樣到預(yù)裝好的親和層析柱上，通過特定的緩沖液洗滌非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。

洗脫與收集：

使用洗脫緩沖液將目標(biāo)蛋白質(zhì)從親和層析柱上洗脫下來。

收集洗脫液，并可能需要進(jìn)一步的純化步驟，如離子交換層析、凝膠過濾層析等。

純度分析與鑒定：

使用SDS-PAGE、Western blotting、質(zhì)譜等技術(shù)對純化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析和鑒定。

在整個過程中，恒溫培養(yǎng)搖床確保了細(xì)胞在表達(dá)蛋白質(zhì)時的生長條件穩(wěn)定，這對于蛋白質(zhì)的正確折疊和功能性至關(guān)重要。同時，通過搖動可以增加培養(yǎng)基中的溶氧量，有助于細(xì)胞生長和提高蛋白質(zhì)的表達(dá)量。純化步驟通常在室溫或4°C進(jìn)行，因此不涉及搖床的使用。