巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

    巨噬細(xì)胞是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞， 具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等重要作用， 被廣泛應(yīng)用于體外免疫增強(qiáng)藥物的非特異性免疫功能。有很多能從多種組織和器官中分離純化巨噬細(xì)胞，但這些方法大多都是繁瑣、復(fù)雜，所需時(shí)間長且耗資較大。本實(shí)驗(yàn)就以小白鼠腹腔巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象， 探索建立一種巨噬細(xì)胞體外分離培養(yǎng)與鑒定簡便的方法。

    首先選取一只小白鼠，腹腔注射不含小牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)液5ml。輕柔小鼠腹部2-3min，靜置5-7min后將小鼠頸椎脫臼處死，至于解剖板上，無菌條件下打開腹腔，用注射器抽取腹腔液，離心5min （1000r/min），棄上清，用pbs洗滌2遍。再用含10%成牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)液（0.1%雙抗溶液）調(diào)節(jié)至2×106ml-1，接種于培養(yǎng)瓶及6孔板，置5%的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)2h，棄上清。用不含小牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)液洗滌2遍，然后加含有10%小牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)液在37℃，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

     巨噬細(xì)胞的觀察與鑒定

     然后稱取4g臺(tái)盼藍(lán)，加少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100ml，用濾紙過濾，4度保存。使用時(shí)。用pbs稀釋至0.4%。； 胰酶消化貼壁細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，并作適當(dāng)稀釋。染色：細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液以9：1混合混勻；

     在三分鐘內(nèi)，分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。鏡下觀察，死細(xì)胞被染成明顯的藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染呈無色透明狀。

     瑞氏染色計(jì)算細(xì)胞純度

     細(xì)胞涂片自然干燥后，用蠟筆在兩端畫線，以防染色時(shí)染液外溢。隨后將玻片平置于染色架上，滴加染液3-5滴，使其蓋滿涂片，大約1分鐘后，滴加等量的染液，用吸耳球輕輕混勻。沖洗：染色5-10分鐘用流水染液，待干， 結(jié)果觀察，將干燥后的血涂片置顯微鏡下觀察。