海洋發(fā)光細(xì)菌和淡水發(fā)光菌

      發(fā)光細(xì)菌作為毒性檢測的生物學(xué)方法，因其簡便、快速、靈敏且成本較低而日益受到重視。本試驗項目推薦兩個方法。一為國家環(huán)境保護(hù)局于1995年發(fā)布的發(fā)光細(xì)菌法（GB/T15441-1995)，采用的是海洋發(fā)光細(xì)菌菌種；二為淡水發(fā)光菌法，采用的是淡水型發(fā)光菌種。
　　明亮發(fā)光桿菌T3法（A)
　　本方法適用工業(yè)廢水、納污水體及實驗室條件下，可溶性化學(xué)物質(zhì)的水質(zhì)急性毒性監(jiān)測。
　　1．原理
　　基于發(fā)光細(xì)菌相對發(fā)光度與水樣毒性組分總濃度呈顯著負(fù)相關(guān)（P≤0.05)，因而可通過生物發(fā)光光度計測定水樣的相對發(fā)光度，以此表示其急性水平。
　　水質(zhì)急性毒性水平可按選用相當(dāng)?shù)膮⒈任?span style="font-family:arial"> HgCl2濃度（以mg/L為單位）來表征，或選用EC50值（半數(shù)有效濃度，以樣品液百分濃度為單位）來表征。
　　2．樣品的采集與保存
　?、俨蓸悠渴褂镁鬯姆蚁┮r墊的玻璃瓶，務(wù)必清潔、干燥。采集水樣時，瓶內(nèi)應(yīng)充滿水樣不留空氣。采樣后，用塑膠帶將瓶口密封。
　?、诙拘詼y定應(yīng)在采樣后6h內(nèi)進(jìn)行。否則應(yīng)在生化培養(yǎng)箱2-5℃下保存樣品，但不得超過24h。報告中應(yīng)寫明水樣采集時間和測定時間。
　?、蹖τ诤腆w懸浮物的樣品須離心或過濾去除，以免干擾測定。
　　3．儀器設(shè)備
　?、偕锇l(fā)光光度計：配置2ml或5ml測試管。
　　當(dāng) HgCl2標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.10mg/L時，發(fā)光細(xì)菌的相對發(fā)光度為50%，其誤差不超過±10%。
　　②2ml或5ml測試樣品管（具標(biāo)準(zhǔn)磨口塞，為制造比色管的玻璃料制作，由專業(yè)玻璃儀器廠制造），分別適用于相應(yīng)型號的生物發(fā)光光度計。
　?、畚⒘孔⑸淦鳎?0μl。
　?、茏⑸淦鳎簂ml。
　　⑤定量加液瓶：5ml。
　?、尬埽?ml、10m1、25ml。
　?、咴噭┢浚簂00ml。
　?、嗔客玻?00ml,500ml。
　?、嶙厣萘科浚?0ml、250ml、1000ml。
　?、獍胛⒘康味ü埽ㄅ淠タ谠囈浩?，全套儀器均為棕色）：l0ml。
　　4．試劑和材料
　　除另有說明外，本方法所用試劑均應(yīng)為符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純試劑、蒸餾水或同等純度的水。
　?、?span style="font-family:arial"> HgCl2。
　?、诼然cNaCl，化學(xué)純。
　　③明亮發(fā)光桿菌T3小種（PhotobacteriumphosphoreumT3spp.）凍干粉，安瓶瓶包裝，每瓶0.5g，在2-5℃冰箱內(nèi)有效保存期為6個月。新制備的發(fā)光細(xì)菌休眠細(xì)胞（凍干粉）密度不低于每克800萬個細(xì)胞；當(dāng)按5(3)④步驟將凍干粉復(fù)蘇2min后即發(fā)光（可在暗室內(nèi)檢驗，肉眼應(yīng)見微光），稀釋成工作液后每毫升菌液不低于1.6萬個細(xì)胞（(5ml測試管）或2萬個細(xì)胞（2ml測試管）（均為稀釋平板法測定）。在生物發(fā)光光度計上測出的初始發(fā)光量應(yīng)在600-1900mV之間，低于600mV允許將倍率調(diào)至“×2”檔，高于1900mV允許將倍率調(diào)整至“×0.5”檔。仍達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)者，更換凍干粉。
　?、苈然c溶液，3g/100m1：取氯化鈉3g于玻璃容器內(nèi)，用量筒加蒸餾水l00ml。
　?、萋然c溶液，2g/l00ml取氯化鈉2g，加蒸餾水l00ml于試劑瓶內(nèi)，2-5℃保存。
　?、迏⒈任?span style="font-family:arial"> HgCl2標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.18、0.20、0.22、0.24mg/L。
　　⑦ HgCl2母液，ρ=2000mg/L:1/萬分析天平精稱密封保存良好的無結(jié)晶水 HgCl20.1000g于50ml容量瓶中，用3g/100m1氯化鈉溶液稀釋至刻度，置2-5℃冰箱備用，保存期6個月。
　?、?span style="font-family:arial"> HgCl2工作液，ρ=2mg/L：用移液管吸 HgCl22000mg/L母液l0ml于l000ml容量瓶中，用3g/l00ml氯化鈉溶液定容。再用移液管吸取 HgCl220mg/L液25ml于250m1容量瓶中，用3g/l00m]氯化鈉溶液定容。將此液倒入配有半微量滴定管的試液瓶，然后用3g/l00ml氯化鈉溶液，將 HgCl22mg/L溶液按表5-3-6稀釋成系列濃度（一律采用50ml容量瓶）。 HgCl2工作液保存期不能超過24h，超過者務(wù)必重配。
　　5.試驗程序
　　(1)稀釋樣品液
　　①樣品液測定前稀釋的條件：
　　樣品液預(yù)試驗：取事先加氯化鈉至3g/l00ml濃度的樣品母液2m1裝入樣品管，并設(shè)一支CK管（氯化鈉3g/100m1溶液），按4②一③所述測定相對發(fā)光度。
　　若測得的樣品，相對發(fā)光度低于50％乃至零，欲以EC50表達(dá)結(jié)果，則需稀釋。
　　若測得的樣品，相對發(fā)光度在1％以上，欲以與相對發(fā)光度相當(dāng)?shù)?span style="font-family:arial"> HgCl2濃度表達(dá)結(jié)果，則不需稀釋。
　?、跇悠芬旱南♂屢海簶悠芬旱南♂屢阂宦捎谜麴s水，在定容前一律按構(gòu)成氯化鈉3g/100ml的濃度添加氯化鈉或濃溶液（母液只能加固體）。
　?、蹣悠芬合♂対舛鹊倪x擇：
　　預(yù)試驗：按對數(shù)系列將樣品液稀釋成五個濃度：100%、10%、1%、0.1%、0.01%（其對數(shù)依次為0、-1、-2、-3、-4)，按5(2）和5(3）所述粗測一遍，視1％-100%相對發(fā)光度落在哪一濃度范圍。
　　正式試驗：在1%-100％相對發(fā)光度所落在的濃度范圍內(nèi)增配到6-9個濃度（例如，若落在0.1％-10％之間，則應(yīng)稀釋成0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%；若落在1％-10％之間，則應(yīng)稀釋成1%、2%、4%、6%、8%、10%)，按5(2）-(3)所述再測一遍；這6-9個濃度，也可通過查對數(shù)表，按等對數(shù)間距原則自行確定（例如，若落在1％-10％之間，則應(yīng)稀釋成10%、6.31%、3.98%、2.51%、1.58%、1.00%其對數(shù)相應(yīng)為1.00、0.80、0.60、0.40、0.20、0.00，對數(shù)間距均為0.2)。
　　(2)測定條件
　?、偈覝兀?0-25℃。
　　同一批樣品在測定過程中要求溫度波動不超過±1℃，且所有測試器皿及試劑、溶液測前1h均置于控溫的測試室內(nèi)。
　?、趐H：若需測定包括pH影響在內(nèi)的急性毒性，不應(yīng)調(diào)節(jié)待測樣品pH。
　　若需測定排除pH影響在內(nèi)的急性毒性，需在測定前將待測樣品和CK（氯化鈉3g/100m1）的pH調(diào)至下值：主要含Cu的水樣為4.5，主要含其他金屬的水樣為5.4，主要含有機(jī)化合物的水樣為7.0。
　?、廴芙庋酰罕痉ㄖ荒軠y定包括溶解氧影響在內(nèi)的急性毒性。
　　(3)測定步驟
　　①試管的排列：于塑料或鐵制試管架上按以下兩種情況排列測試管。
　　a．按5(1)①所述，樣品母液相對發(fā)光度為1％以上者，如下排列：
　　左側(cè)放參比物 HgCl2系列濃度溶液管，右側(cè)放樣品管。前排放 HgCl2溶液和樣品管，后一排放對照（CK）管，后二排放CK預(yù)試驗管。每管 HgCl2或樣品液均配一管CK（氯化鈉3g/100m1蒸餾水溶液）。設(shè)三次重復(fù)。每測一批樣品，均需同時配置測定系列濃度 HgCl2標(biāo)準(zhǔn)溶液。
　　b．按5(1)①所述，樣品母液相對發(fā)光度為50％以下乃至零者，如下排列：
　　左側(cè)僅放 HgCl20.10mg/L溶液管（作為檢驗發(fā)光細(xì)菌活性是否正常的參比物濃度，其反應(yīng)15min后的相對發(fā)光度應(yīng)在50％左右），右側(cè)放樣品稀釋液管（從低濃度到高濃度依次排列）。其他同a。每測一批樣品，均需同時配測 HgCl20.10mg/L溶液。
　?、诩?g/l00ml氯化鈉溶液：用5ml的定量加液瓶給每支CK管加2m1或5ml氯化鈉3g/l00ml（據(jù)儀器型號而定）。
　?、奂訕悠芬海河?ml或5ml吸管給每支樣品管加2ml或5ml樣品液（據(jù)5(3)②而定）。每個樣品號換一支吸管。
　?、馨l(fā)光細(xì)菌凍干菌劑復(fù)蘇
　　從冰箱冷藏室2-5℃取出含有0.5g發(fā)光細(xì)菌凍干粉的安瓿瓶和氯化鈉溶液，投入置有冰塊1-1.5L保溫瓶，用lml注射器吸取0.5m1冷的氯化鈉2g/l00m1（適用于5ml測試管）或lml冷的2.5%氯化鈉（適用于2m1測試管）注入已開口的凍干粉安瓿瓶，務(wù)必充分混勻。2min后菌即復(fù)蘇發(fā)光（可在暗室內(nèi)檢驗，肉眼應(yīng)見微光）。備用。
　?、輧x器的預(yù)熱和調(diào)零：打開生物發(fā)光光度計電源，預(yù)熱15min，調(diào)零，備用。
　?、鄼z驗復(fù)蘇發(fā)光細(xì)菌凍千粉質(zhì)量：另取一空2m1或5ml測試管加2m1或5ml氯化鈉3g/100ml（據(jù)5(3)②而定），加10μ1復(fù)發(fā)光菌液，蓋上瓶塞，用手顛倒五次以達(dá)均勻。拔去瓶塞，將該管放入各自型號儀器測試艙內(nèi)，若發(fā)光量立即顯示（或經(jīng)過5-l0min上升到）600mV以上，此瓶凍干粉可用于測試，低于者按4③處理。菌液發(fā)光量先緩慢上升，約持續(xù)5-15min，后緩慢下降，約持續(xù)4h。滿4h的CK發(fā)光量應(yīng)不低于400mV，低于者更換凍干粉。
　?、呓o各測試管加復(fù)蘇菌液：在發(fā)光菌液復(fù)蘇穩(wěn)定（約0.5h)后，按5(3)所述，從左到右，按 HgCl2或樣品管（前）-CK管（后）一 HgCl2或樣品管（前）-CK管（后）…順序，用10μl微量注射器（勿用定量加液器以減少誤差）準(zhǔn)確吸取10μl復(fù)蘇菌液，逐一加入各管，蓋上瓶塞，用手顛倒五次，拔去瓶塞，放回原位（每管加菌液間隔時間勿短于30s。每管在加菌液的當(dāng)時務(wù)必計時，記錄到秒，即為樣品與發(fā)光菌反應(yīng)起始時間。立即將此時間加15min，記作各管反應(yīng)終止（即應(yīng)該讀發(fā)光量）的時間。
　?、喟l(fā)光細(xì)菌與樣品反應(yīng)達(dá)到終止時間的讀數(shù)：按各管原來加菌液的先后順序，當(dāng)某管達(dá)到記錄的反應(yīng)終止時間，在不加瓶塞的情況下，立即將測試管放入儀器測試艙，讀出其發(fā)光量（以光信號轉(zhuǎn)化的電信號一電壓毫伏數(shù)表示）。
　?、嵊猩珮悠窚y定干擾的校正：
　　a．拿掉儀器樣品艙上的黑色塑料管口；
　　b．?。?m1測試管（直徑12mm)，加氯化鈉3g/ml溶液2m1，將該管放進(jìn)一裝有少量氯化鈉3g/100m1溶液的5ml管（直徑20mm）內(nèi)，要使外管與內(nèi)管的氯化鈉3g/l00ml液面平齊。此作CK管；
　　c．另取一2ml測試管，加氯化鈉3g/ml溶液2ml，放入另一裝有少量有色待測樣品液的5ml管內(nèi)，要使外管與內(nèi)管的氯化鈉3g/ml液面平齊。此作CKc管；
　　d．于CK和CKc二管的內(nèi)管中同時加復(fù)蘇發(fā)光菌液10μ1（注意：必須是本批樣品測
　　定所用同一瓶復(fù)蘇菌液），立即記時到秒，等反應(yīng)滿15min，迅速放入儀器測試艙，測定兩支帶有內(nèi)管的5ml測試管的發(fā)光量。分別記下發(fā)光量Ll(CK管）和L2(CKc管）；
　　e．計算因顏色引起的發(fā)光量（mV）校正值ΔL=L1一L2；
　　f.按5(3)⑦和5(3)⑧所述常規(guī)步驟測試帶色樣品管及其CK管（氯化鈉3g/l00ml溶液）的發(fā)光量（mV)。所有CK管測得之發(fā)光量（mV）均須減去校正值ΔL(mV）后才能作為CK發(fā)光量（mV)。
　　有色樣品溶液測定干擾的校。
　　6．質(zhì)量保證與質(zhì)量控制
　?、倜恐Оl(fā)光菌的發(fā)光強(qiáng)度和穩(wěn)定性不盡相同，同批樣品測定過程中應(yīng)使用同一支發(fā)光菌，如果需做 HgCl2標(biāo)準(zhǔn)曲線，也應(yīng)與樣品使用同一支發(fā)光菌。如果一支不夠用，可采用同批的兩支混合后使用。
　?、谏弦话阃ㄓ梅磻?yīng)時間為5min或15min兩種，鑒于我國目前所用發(fā)光桿菌的靈敏度和穩(wěn)定性，采用15min。
　?、廴沃貜?fù)測定結(jié)果相對偏差確定為≤1％。
　?、軠y定應(yīng)在采集樣品后立即進(jìn)行，在6h內(nèi)不能測定應(yīng)低溫保存，但不得超過24h。
　　⑤關(guān)于樣品如何稀釋的問題，一般根據(jù)樣品毒性大小決定，但是在試驗中至少要選擇六個不同濃度。如果六個濃度的相對發(fā)光度在1%-100％之外，可增配若干個濃度，使之落在1%-100％相對發(fā)光度范圍內(nèi)，以求相關(guān)方程。
　　⑥如果樣品濃度為MAX高極限濃度（即100%）時，其相對發(fā)光率都不能使發(fā)光強(qiáng)度減少50%，則對樣品的EC50值只能示為＞100%。
　?、哞b于發(fā)光細(xì)菌法實驗因素的影響，實驗結(jié)果具有一定誤差。在評價毒物的劑量一效應(yīng)關(guān)系時，應(yīng)確定95％置信區(qū)間，即T=a+bC±2SE（SE為剩余標(biāo)準(zhǔn)差），以此求出的EC50也有一定的區(qū)間，可根據(jù)這些結(jié)果確定實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和真實性。對于實驗結(jié)果的重現(xiàn)性，就大多數(shù)而言，一般EC50值的變異系數(shù)在6％-10%。
　　7.測試結(jié)果的表達(dá)
　　1)計算樣品相對發(fā)光度（％），并算出平均值：
　　相對發(fā)光度（%)= HgCl2管或樣品管發(fā)光量（mV)/CK管發(fā)光量（mV)×100
　　相對發(fā)光度（％）平均值＝（重復(fù)1）（%）+（重復(fù)2）（%）+（重復(fù)3）（%）/3
　　2）符合5(1)①中樣品母液相對發(fā)光度在1％以上者，建立并檢驗 HgCl2濃度（C)與其相對發(fā)光度（T，％）均值的相關(guān)方程，也可以繪制關(guān)系曲線。
　?、偾蟪鲆辉淮尉€性回歸方程的a（截距）、b（斜率、回歸系數(shù)）和r（相關(guān)系數(shù)），列出方程：
　　T=a+bC HgCl2
　　查相關(guān)系數(shù)顯著水平（P值）表，檢驗所求r值的顯著水平。若P≤0.01，且EC50 HgCl2=0.lomg/L±0.02mg/L，則所求相關(guān)方程成立；反之，不能成立，必須重測系列 HgCl2濃度的發(fā)光量。 HgCl2溶液配制過夜者，必須重配后再測定。
　　②也可以據(jù)建立的上述方程繪制關(guān)系曲線。即發(fā)光度為10％和90%，代入上式，求出相應(yīng)的二個 HgCl2濃度，在常數(shù)坐標(biāo)紙上，定出二點，畫一直線，即為符合該方程的 HgCl2濃度與相對發(fā)光度的關(guān)系曲線。
　　3)符合5(1)①中樣品母液相對發(fā)光度低于50％乃至零，欲以EC50表示結(jié)果者，建立并檢驗樣品稀釋濃度（C）與其相對發(fā)光度（T)均值的相關(guān)方程，繪制關(guān)系曲線。
　　按7之2)所述方法建立相關(guān)方程T=a+bC樣，并檢驗相關(guān)系數(shù)r、顯著水平（P值）。
　　若P≤0.05，則所求相關(guān)方程成立；反之，不能成立，必須重測樣品稀釋系列濃度的發(fā)光量。
　　8．結(jié)果評價和報告
　　(1)用 HgCl2濃度表達(dá)樣品毒性
　　1)適用的條件：符合條件（樣品母液相對發(fā)光度＞1%）并按7之2)建立了合格（(P≤0.01、EC50 HgCl2=0.10mg/L±0.02mg/L）的 HgCl2濃度與其相對發(fā)光度相關(guān)方程者。
　　2）表達(dá)方法：
　　①將測得的樣品相對發(fā)光度，代入7之2)的相關(guān)方程，求出與樣品急性毒性相當(dāng)?shù)?span style="font-family:arial"> HgCl2濃度（一般用mg/L）表示。
　?、跍y試結(jié)果報告同時列舉樣品相對發(fā)光度及其相當(dāng)?shù)?span style="font-family:arial"> HgCl2濃度值。
　　3)適用性：適用于相對發(fā)光度在1％以上，特別是50％以上（即不可能出現(xiàn)EC50值）但低于100%（即仍有中、低水平毒性）的樣品毒性測定。
　　(2)用EC50值表達(dá)樣品毒性
　　1)適用的條件：符合條件（樣品母液相對發(fā)光度低于50％乃至零）并按7之3)建立了合格（P≤0.01）的樣品稀釋液濃度與其相對發(fā)光度相關(guān)方程者。
　　2）表達(dá)方法：
　　①將T代入7之3)建立的相關(guān)方程，求出樣品的EC50值。這里的EC50值以樣品的稀釋濃度（一般用百分濃度）表示。
　?、跍y試結(jié)果報告列舉樣品的EC50值。
　　3）適用性：適用于相對發(fā)光度在50％以下，特別是零（即毒性水平較高或很高）的樣品毒性測定，后者無法以相當(dāng)?shù)?span style="font-family:arial"> HgCl2濃度表達(dá)毒性。
　　(3）測定記錄格式
　　(4）測定結(jié)果報告
　?、賹嶒炇沂覝?。
　　②采樣地點、日期、時間。
　?、?span style="font-family:arial"> HgCl2濃度或樣品稀釋百分濃度與相對發(fā)光度的相關(guān)方程：
　　T=a+bC
　　r= P≤ EC50 HgCl2= mg/L
　　L=a+bC a= b=
　　回歸方程 r= P＜
　　④樣品EC50值（稀釋百分濃度）或相對發(fā)光度（％）及相當(dāng)?shù)?span style="font-family:arial"> HgCl2濃度（mg/L）。