蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

         測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的方法有很多，科研工作者廣泛使用的方法比如紫外吸收法，雙縮脲法，BCA方法，Lowry法，考馬斯亮藍(lán)法，凱氏定氮法等等 ，今天小編以UV法，BCA法，考馬斯亮藍(lán)法，其中的三種方法的測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理、優(yōu)缺點(diǎn)、操作以及注意事項(xiàng)做詳細(xì)介紹。
         UV法
         這種方法是在280nm波長(zhǎng)，直接測(cè)試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測(cè)定過(guò)程非常簡(jiǎn)單，先測(cè)試空白液，然后直接測(cè)試蛋白 質(zhì)。從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō)，速度快，操作簡(jiǎn)單；但是容易受 到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
         （1）簡(jiǎn)易經(jīng)驗(yàn)公式
蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor
         （2）計(jì)算
通過(guò)計(jì)算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通過(guò)如下公式計(jì)算MAX終結(jié)果：
蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D
其中d為測(cè)定OD值比色杯的厚度
D為溶液的稀釋倍數(shù) 
         BCA法
         原理
         BCA（bicinchonininc acid）與二價(jià)銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑混合一起即成為蘋(píng)果綠，即 BCA 工作試劑。在堿性條件下，BCA 與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，蛋白質(zhì)將 Cu2+ 還原為 Cu+，工作試劑由原來(lái)的蘋(píng)果綠色變?yōu)樽仙珡?fù)合物。562 nm 下其光吸收強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度成正比。BioVision的BCA蛋白檢測(cè)試劑盒提供了一種簡(jiǎn)單快速并且耐去污劑（大于5%）的手段檢測(cè)溶液中蛋白質(zhì)濃度.
         成分
試劑 A 100 mL
試劑 B 2 mL
標(biāo)準(zhǔn)蛋白（BSA） 1 mL×2，1 mg/mL 
保存條件
運(yùn)輸溫度：室溫（標(biāo)準(zhǔn)蛋白 4～8 ℃ 運(yùn)輸）
保存溫度：室溫（標(biāo)準(zhǔn)蛋白 -20 ℃ 保存）
有效日期：12 個(gè)月
         使用方法
         方法一：96 孔板
1. 配制 BCA 工作液：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按 50 體積試劑 A，1 體積試劑 B 配制適量 BCA 工作液。充分混勻。
2. 將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按 0 μL，1 μL，2 μL，4 μL，6 μL，8 μL，10 μL 加入 96 孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中。加滅菌雙蒸水補(bǔ)足到 10 μL。取 10 μL 待測(cè)樣品加入 96 孔板的待測(cè)樣品孔中。每個(gè)測(cè)定要做 2～3 個(gè)平行。
3. 向待測(cè)樣品孔和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中各加入 200 μL BCA 工作液（即樣品與工作液的體積比為 1:20），混勻。
4. 37 ℃ 恒溫水浴鍋溫浴 30 min。冷卻至室溫。
5. 酶標(biāo)儀 562 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。
6. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出樣品濃度。
         方法二：試管法
1. 配制工作液：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按 50 體積試劑 A，1 體積試劑 B 配制適量 BCA 工作液，充分混勻。工作液配制的量要與測(cè)定所用的比色杯對(duì)應(yīng)。每個(gè)測(cè)定要做 2～3 個(gè)平行。本處列舉的比色體系所用的是 0.5 mL 的比色杯。如比色杯規(guī)格不同，體系需要放大到實(shí)驗(yàn)將采用的比色杯準(zhǔn)確讀數(shù)所需要的體積。
2. BSA 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的準(zhǔn)備：樣品用水或其它不干擾顯色反應(yīng)的緩沖液配制，使待測(cè)定的濃度位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分。每個(gè)反應(yīng)準(zhǔn)備 3 個(gè)平行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線一般 5~6 個(gè)點(diǎn)即可。根據(jù)樣品的估測(cè)濃度確定各點(diǎn)的具體濃度。稀釋 BSA 時(shí)可以用水或與樣品一致的溶液。如待測(cè)樣品的濃度約為 200 μg/mL，可按下表的次序加入 BSA 標(biāo)準(zhǔn)品、樣品及 BCA 工作液。
3. 取適量體積的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，以蛋白液：工作液=1:20 的比例混勻。37 ℃恒溫水浴鍋溫浴 30 min。冷卻至室溫。
4. 將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品在 562 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。
         考馬斯亮藍(lán)法
         實(shí)驗(yàn)原理
         考馬斯亮藍(lán) (Coomassie Brilliant Blue) 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理，定量測(cè)定微量蛋白濃度快速、靈敏的方法。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。目前，這一方法是也靈敏度MAX高的蛋白質(zhì)測(cè)定法之一。
考馬斯亮藍(lán) G-250 染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的MAX大吸收峰 (lmax) 的位置，由 465 nm 變?yōu)?595 nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。通過(guò)測(cè)定 595 nm 處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。研究發(fā)現(xiàn)，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸 (特別是精氨酸) 和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。
突出優(yōu)點(diǎn)
（1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比 Lowry 法約高四倍，其MAX低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá) 1 mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比 Lowry 法要大的多。
（2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要 5 分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程，大約只要 2 分鐘即可完成，其顏色可以在 1 小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在 5 分鐘至 20 分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性適宜。因而*不用像 Lowry 法那樣費(fèi)時(shí)和需要嚴(yán)格地控制時(shí)間。
（3）干擾物質(zhì)少。如干擾 Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+ 離子、Tris 緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA 等均不干擾此測(cè)定法。
缺點(diǎn)
（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考馬斯亮藍(lán)染色法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用 g-球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。
（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉 (SDS) 等。
         試劑與器材
         1、試劑
考馬斯亮藍(lán)試劑：
考馬斯亮藍(lán) G-250 100 mg 溶于 50 mL 95% 乙醇中，加入 100 mL 85% 磷酸，用蒸餾水稀釋至 1000 mL。
         2、標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液
（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液
結(jié)晶牛血清蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，根據(jù)其純度用 0.15 mol/L NaCl 配制成 1 mg/mL 蛋白溶液。
（2）待測(cè)蛋白質(zhì)溶液。
人血清，使用前用 0.15 mol/L NaCl 稀釋 200 倍。
         3、器材
試管 1.5×15 cm（×6），試管架，移液管管 0.5 mL（×2）;1 mL（×2）;5 mL（×1）；恒溫水浴；分光光度計(jì)。 
         操作方法
         一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
取 7 支試管，按下表平行操作。
搖勻，1 h 內(nèi)以 0 號(hào)管為空白對(duì)照，在 595 nm 處比色。
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以 A595 nm 為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 
         二、未知樣品蛋白質(zhì)濃度測(cè)定
測(cè)定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)。根據(jù)所測(cè)定的 A595 nm 值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。
         注意事項(xiàng)
（1）在試劑加入后的 5-20 min 內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是MAX穩(wěn)定的。
（2）測(cè)定中，蛋白-染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上，測(cè)定完后可用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。
（3）利用考馬斯亮藍(lán)法分析蛋白必須要掌握好分光光度計(jì)的正確使用，重復(fù)測(cè)定吸光度時(shí)，比色杯一定要沖洗干凈，制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的時(shí)候，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品建議是從低濃度到高濃度測(cè)定，防止誤差。