Transwell遷移/侵襲實(shí)驗(yàn)

        基本原理

        將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對(duì)細(xì)胞生長、運(yùn)動(dòng)等的影響。

        應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。侵襲實(shí)驗(yàn)中使用到的Matrigel 是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質(zhì)成分，含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖，鋪在無聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上，能在DMEM培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu)，這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。

        Transwell小室的濾膜孔徑一般為8μm，在侵襲實(shí)驗(yàn)中，膜孔都被Matrigel覆蓋，細(xì)胞不能自由穿過，必須分泌水解酶，并通過變形運(yùn)動(dòng)才能穿過這種鋪有Martrigel 的濾膜，這與體內(nèi)情況較為相似。細(xì)胞欲進(jìn)入下室，先要分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）將基質(zhì)膠降解，方可通過聚碳酸酯膜。計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

        所需材料

ØTranswell小室

Ø細(xì)胞生長培養(yǎng)基

Ø胎牛血清

Ø胰蛋白酶

ØPBS

Ø青霉素-鏈霉素溶液（100×）

Ø結(jié)晶紫或臺(tái)盼藍(lán)

Ø甲醇

ØMatrigel（侵襲實(shí)驗(yàn)）

        主要試劑配置

（1）PBS磷酸鹽緩沖液： PBS粉劑每袋加ddH2O定容至1000ml，調(diào)pH7.2，121℃，30min，高壓滅菌，4℃保存。

（2）細(xì)胞生長培養(yǎng)基：低溫培養(yǎng)箱-20℃保存，臨用前按體積比配成含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素雙抗的*培養(yǎng)液。

        操作步驟

1．所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑和細(xì)胞培養(yǎng)池放在電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃溫育；

2．待測細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，消化細(xì)胞，用PBS和無血清培養(yǎng)基先后洗滌1次，用無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為2×105 /ml；

3．如進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)，將Matrigel膠從-20℃取出于4℃冰箱過夜，在4℃條件下將Matrigel膠用無血清的細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至300 μl/ml，取100 μl均勻涂抹一層于細(xì)胞培養(yǎng)池的PET膜上表面，然后將培養(yǎng)池輕輕放入24孔板孔內(nèi)，37℃放置3 h左右，取出于超凈工作臺(tái)過夜干燥。

注：如進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)，則跳過這一步驟

4．在下室（即24孔板底部）加入600－800 μl 含10％血清的培養(yǎng)基，上室加入100－150 μl細(xì)胞懸液，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)24 h；

5．將其下表面浸泡在70%甲醇溶液中，固定30 min~60 min，用結(jié)晶紫或臺(tái)盼藍(lán)染色，鏡檢，并計(jì)算PET膜下表面的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算中間和四周5個(gè)視野，取平均值。

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果

鏡下對(duì)染色后的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)值高，則該組細(xì)胞遷移/侵襲能力強(qiáng)。

        以上設(shè)備詳情，請(qǐng)咨詢上海喆圖。