如何用二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、傳代及凍存實(shí)驗(yàn)

一  復(fù)蘇 傳代

（1） 準(zhǔn)備

   無菌超凈臺(tái)，酒精燈，75%酒精噴壺，二氧化碳培養(yǎng)箱，37℃水浴鍋，離心機(jī)；培養(yǎng)瓶，含10%胎牛血清的*培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及PBS磷酸緩沖液（提前放置超凈臺(tái)使平衡到室溫），無菌工作服（白大褂），口罩，手套，記號(hào)筆

（2） 步驟

   1.穿好無菌工作服，帶上口罩和手套，快速從液氮里取出凍存管，快速放進(jìn)37℃水浴鍋緩慢搖晃使細(xì)胞解凍，注意凍存管的封口膜不要破裂，防止污染。

   2.解凍后用紙擦干凍存管表面的水滴，酒精噴壺噴灑適量75%酒精消毒凍存管封口處。

   3.開超凈臺(tái)，點(diǎn)燃酒精燈燃燒片刻后（可提前準(zhǔn)備），凍存管放超凈臺(tái)，換新手套，小心打開凍存管，避免污染，無菌吸管將1ml細(xì)胞全部吸出至5ml無菌EP管，補(bǔ)加9ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋，1000rpm，離心5min使細(xì)胞沉淀，棄上清。

   4.加入新鮮配制的含10%血清的培養(yǎng)基4ml，輕輕混勻，用吸管將細(xì)胞移至25T培養(yǎng)瓶。

   5.平躺放置培養(yǎng)瓶，8字形混勻后，置于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

   6.培養(yǎng)24小時(shí)后，顯微鏡觀察細(xì)胞（貼壁細(xì)胞）貼壁后，小心更換培養(yǎng)基，根據(jù)不同細(xì)胞的生長狀態(tài)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶上標(biāo)記：操作者，時(shí)間，細(xì)胞類型。

   7.有的實(shí)驗(yàn)員的培養(yǎng)基會(huì)加入抗生素防止細(xì)胞污染，但是這對于掌握細(xì)胞培養(yǎng)是非常不利的，不加抗生素培養(yǎng)細(xì)胞更能提醒實(shí)驗(yàn)者無菌操作的意識(shí)。一旦細(xì)胞出現(xiàn)污染，易于發(fā)現(xiàn)，一旦發(fā)現(xiàn)污染的細(xì)胞應(yīng)立刻煮沸丟棄，以免污染同實(shí)驗(yàn)室其他細(xì)胞。

   8.細(xì)胞長滿90%-100%即可傳代，小心打開培養(yǎng)瓶，瓶口過酒精燈消毒，棄培養(yǎng)基。

   9.加入1mlPBS，潤洗細(xì)胞，重復(fù)3次，棄PBS。

   10.加入4ml*培養(yǎng)基，用無菌吸管小心吹打貼壁細(xì)胞或者用胰蛋白酶消化細(xì)胞使細(xì)胞脫落。

   11.轉(zhuǎn)移1/2脫落的細(xì)胞至新的培養(yǎng)瓶，各瓶補(bǔ)加*培養(yǎng)基至4ml。

   12.小心封口，平躺放置培養(yǎng)瓶，8字形混勻后，置于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

   13.待長滿后，按同樣的方法傳代培養(yǎng)。

二  凍存

當(dāng)不需要使用細(xì)胞或者細(xì)胞量足夠時(shí)，可以將細(xì)胞凍存起來，供以后實(shí)驗(yàn)用

（1） 準(zhǔn)備

    細(xì)胞凍存液（20%血清、10%DMSO、70%基礎(chǔ)培養(yǎng)液），梯度降溫盒

（2） 步驟

        1.選取活力好，密度約70%細(xì)胞用于凍存，此時(shí)細(xì)胞處于對數(shù)生長期，用于凍存。

        2 .細(xì)胞吹打或者胰酶消化后，轉(zhuǎn)移至無菌EP管，1000rpm里面5min。

        3.棄上清，加入新鮮配制的細(xì)胞凍存液，25T細(xì)胞可以加入2ml細(xì)胞凍存液，分裝2個(gè)凍存管，細(xì)胞*密度為5*106-1*107個(gè)每ml。

        4.做好標(biāo)記，放入梯度降溫盒（提前平衡至室溫）。

        5.將梯度降溫盒放入-80℃冰箱過夜，第二天取出凍存管，快速放入液氮保存。

遵循“快速復(fù)蘇，緩慢凍存”的原則。