怎么用培養(yǎng)箱進行初代細胞培養(yǎng)實驗？

初代培養(yǎng)或原代培養(yǎng)，是從供體獲取組織后的培養(yǎng)。其zui大優(yōu)點是：組織和細胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大的變化，具有二倍體遺傳性狀，在供體來源充分、生物條件穩(wěn)定的情況下（年齡、性別），在一定程度上能反映體內(nèi)狀態(tài)。
實驗方法原理：
合成培養(yǎng)基胰蛋白酶消化培養(yǎng)法，能把組織塊分散成細胞團或單個細胞，便于細胞從培養(yǎng)液中攝取營養(yǎng)和排出代謝產(chǎn)物，細胞能較快地長成單層。
本法尤適用于培養(yǎng)大量組織，細胞產(chǎn)量高；但用于經(jīng)常性小量培養(yǎng)工作稍顯繁瑣，無菌操作不良時且易污染。
實驗材料：試劑、試劑盒 Hanks、培養(yǎng)液、胰蛋白酶
儀器、耗材：吸管、平皿、培養(yǎng)瓶、燒杯、攪拌器、三角燒瓶、不銹鋼篩、眼科剪、眼科鑷、計數(shù)板
實驗步驟：
1. 準備
取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒20 分鐘；
2. 布局
點燃酒精燈（或煤氣燈），安裝吸管帽（應(yīng)通過火焰）；
3. 處理組織
把組織塊置入燒杯中，用Hanks液漂洗2~3 次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60 分鐘；
4. 剪切
用眼科剪把組織塊切成2~3 毫米大小的塊（用手術(shù)刀割亦可），以便于消化；加入比組織塊總量多30~50 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結(jié)扎瓶口或塞以膠塞；
5. 消化
或用恒溫水浴，或置入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱消化均可，消化中每隔20 分鐘應(yīng)搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好（消化前瓶中需置一無菌攪棒）；消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定；
6. 分離
在消化過程中見消化液發(fā)混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊（必要時可繼續(xù)進行消化）；低速（500~1000 轉(zhuǎn)/分）離心消化液5 分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液（如有其它酶或EDTA 等消化，需用Hanks液洗脫一兩次后，再加入培養(yǎng)液）；
7. 計數(shù)
用計數(shù)板計數(shù)，如細胞懸液細胞密度過大，再補加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中；對大多數(shù)細胞來說，pH 要求在7.2~7.4范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說膽液體變酸，可用NaHCO3調(diào)整；
8. 培養(yǎng)
置入36.5 ℃溫箱培養(yǎng)；如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽（松口）堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時需更換新塞。
注意事項：
1. 組織塊、胰蛋白酶、培養(yǎng)液等易受紫外線傷害的物品，在培養(yǎng)時再攜入操作野；如預(yù)先置入，需用紙張覆蓋，以免受射線影響；開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部（工作時宜挽上袖口）。